課堂 | 連續斷層3D重構中的超薄切片制備，ARTOS 3D了解一下？

當需要以納米級分辨率觀察樣品超微結構時，科學家通常借助電子顯微鏡（觀察表面結構的掃描電鏡 SEM 和觀察內部結構的透射電鏡 TEM）——它們是當前科研界可使用的大顯微成像工具。
 

電鏡成像要求對樣品進行通常 20-150 nm的超薄切片，使用超薄切片機切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且無人為干擾因素，因此可以滿足電鏡成像對制備樣品的嚴苛要求。如果大量超薄切片具有樣品結構的前后連續性，SEM 成像采集的圖像就可以進行樣品內部結構的 3D 重建，形成可用于分析的完整超微、精細立體圖像，即連續斷層成像技術（Array Tomography, AT）。

今天，小編簡要介紹一下 AT 成功的關鍵環節：連續超薄切片樣品制備。

超薄切片之重要性

AT 常用于細胞、蛋白質等生物 / 生物大分子結構的納米分辨率、3D 結構觀察和分析，主要步驟為包埋樣品連續（超薄）切片、TEM / SEM 或光學顯微鏡對其進行成像、對獲得的一系列圖像進行重建分析。AT 可以獲得的有效信息包括超微結構的定量、體積分析和細胞 / 蛋白的形態學數據等，相較于共聚焦顯微鏡獲得的圖像，具有更高的水平和空間分辨率（可達 0.2 nm）。

超薄切片主要用于 TEM 成像前的樣品制備，以納米分辨率觀察樣品內部結構信息。無污染且獲取快速的超薄切片的主要優勢在于：

·      整個切片均可用于電鏡成像，適合大尺寸樣品分析；

·      單張切片電子透射均一性好，保證結果可靠性；

·      制備速度快，短時間即可獲得大量切片；

·      適用樣品范圍廣，生物樣本和工業材料均適用。

超薄切片的基本原理

對于 TEM 或者 3D 結構重建，樣品高質量連續切片是前提。因此，一臺如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D（20-50 nm）（見圖 1）一樣穩定可靠的超薄切片機是開展實驗的*工具。

▲圖 1. Leica 連續超薄切片機新品 —— EM ARTOS 3D

樣品被安裝在可上下前后準確移動的電動機械臂上，機械臂垂直上下移動、遇到固定的玻璃刀或鉆石刀時，一條樣品帶被切下（圖 2），然后刀臺自動向左移動，按照設定的切片厚度完成第二條切割。同理，隨后刀臺再向左移動，完成第三條切割（圖 3）。從刀片上直接取下切片是十分困難的，因為它非常薄且脆弱，徠卡超薄切片機采用溫和水流托舉的方式使條帶不斷分離，能夠保證條帶質量不被破壞同時操作極其簡單（冷凍切片情況可借助顯微操作），然后進行上電鏡前的其它必要處理。

▲ 圖 2. EM ARTOS 3D 超薄切片機樣品切割位置基本結構

▲ 圖 3. EM ARTOS 3D 制備的連續超薄切片條帶

連續斷層成像的樣品制備

多數未處理的生物樣品比較柔軟，AT 成像前的樣品制備主要包括下面幾個步驟：

·      組織固定

·      樣品水分抽提和包埋

·      連續切片和切片條帶收集

·      切片染色以用于成像（如果需要）

后使用 SEM 或光學顯微鏡（通常熒光成像情況）對結構上具有連續性的切片進行成像，合成圖像以進行 3D 重建和分析。

對于市面上多數超薄切片機，使用者在 AT 成像的樣品制備時，通常會發現這是一項耗時耗力、中間一些操作必須手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的 3D 連續超薄切片機，能夠自動化連續切片、顯著縮短樣品制備時間、減少人工操作、切片無褶皺、厚度均一、溫和水流取條帶、提高樣品制備成功率等眾多優點，在向下兼容普通超薄切片需要的同時，特別合適高通量切片和 AT 等前沿研究對樣品制備的嚴苛要求。

數據展示

▲ 圖 4. AT 技術獲得的鼠淋巴結 3D 結構重建

來自：Science and Technology (IST) Austria, Klosterneuburg

相關文獻：

1. Variety of RNAs in Peripheral Blood Cells, Plasma, and Plasma Fractions

2. High Resolution Array Tomography with Automated Serial Sectioning