如何使用熒光顯微鏡觀察細胞

免疫熒光
IF是一種通過熒光基團標記檢測細胞內有機分子，胞內定位及其相互作用關系的成像研究手段。IF制劑可通過多種顯微鏡技術（如激光共聚焦、寬場熒光、全內反射成像等）來加以分析，具體取決于應用目的或研究人員的關注重點。與此同時，在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當中，IF早已成為*的一部分。
IF實驗的核心部分是兩種不同組分的組合：

• 首先是特異性抗體，用于形成免疫復合物來標記細胞內需要研究的分子，大多數(shù)情況下為蛋白質。

• 其次是熒光色素，與免疫復合物耦合，可以利用顯微鏡進行觀察目標結構。

圖1：圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程，上皮細胞粘附在蓋玻片上生長。培養(yǎng)后細胞被固定，因此用化學交聯(lián)劑（如甲醛）將其殺死。再用清潔劑進行透化處理，使抗體穿過細胞膜。用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白來進行封閉，可減少抗體與非靶向結構的非特異性結合，從而減少假陽性信號。接下來與一抗進行孵育，特異性識別靶向分子上的表位。在第二個培育步驟中，應用熒光耦合二抗，與一抗結合來實現(xiàn)靶向結構的可視化觀察。抗體孵育后，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進行細胞核染色。在顯微鏡載玻片上涂有封固介質（例如Mowiol或Prolong Gold）的蓋玻片后，IF即已準備好進行顯微鏡觀察。

直接與間接免疫熒光
根據(jù)實驗類型的不同，有兩種不同的IF變體可以使用：第一種是直接IF或一級IF，一種具有特異性的一抗，能夠與熒光色素連接用于結合靶向結構并實現(xiàn)直接可視化觀察。
第二種變體是指間接或二級IF，這種變體需要采用兩步式培育。首先，特異性一抗識別靶向結構。然后應用與一抗特異結合的熒光色素耦合二抗。這種特異性是通過引導二抗抵御產生一抗的物種而獲得的（見‘抗體和熒光色素’章節(jié)）。比較兩種IF變體可見兩者各有不同的優(yōu)缺點：
通過耦合一抗和熒光色素，耗時的清洗和培育步驟被省略，所以直接IF比間接IF更快。因此，直接IF更易于處理，適合于在標準IF實驗中（例如在臨床實踐中）對樣本進行快速分析。但必須使用一種功能良好且對其抗原高度敏感的一抗。這同時也是一個缺點，因為熒光耦合和驗證的一抗成本較為高昂。此外，每個靶向結構都需要一個單獨的一抗，與間接IF相比，抗體與直接IF中的熒光色素的連接限制了設計實驗的靈活性。
這種靈活性是間接IF的顯著優(yōu)勢之一。通常在IF反應過程中，同一樣本都會有幾個不同的靶結構需要實現(xiàn)可視化觀察，因此必須為每個靶向分子選擇一個離散的熒光色素。
在間接IF中，不同的熒光耦合二抗可以與不同的一抗結合（當然還要考慮到物種的反應性）。相較之下，如果想在直接IF中對靶向結構“玩"顏色組合，則需要為每一種顏色使用單獨的一抗。間接熒光的另一個優(yōu)點是二抗的信號放大。多個二抗分子可與一個一抗結合來實現(xiàn)熒光增強，這意味可減少使用一抗。
間接IF的工作流程可能需要花費更多時間，但由于一抗和二抗能夠組合而且整個操作過程的經濟性更高，因此間接熒光成為了絕大多數(shù)研究人員的首要選擇方法。

圖2：有兩種方法通過免疫熒光顯示靶向結構：在兩種變體中，一種特異的一抗用于識別靶分子上的特定表位。在此圖中，目標分子由幾個相同的蛋白質亞單位（=大分子）組成，因此會在每個亞單位上表現(xiàn)出幾個相同類型的表位。為方便簡化，此處只描繪了一個表位。

直接IF中，一抗直接連接到熒光色素，在顯微鏡下觀察靶向結構。間接IF中，熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用，從而專門對一抗進行標記。因為多個二抗分子可以結合到一個一抗上，所以選擇抗體和熒光色素的靈活性更大，并能夠進一步放大信號。

抗體與熒光色素

高質量的IF染色當中，最重要的工具是良好的一抗。同時，幾乎每種細胞類型中的每種蛋白質都有一種或幾種市售抗體。但此處需要強調若干重要注意事項。
要根據(jù)IF染色來做出精確的科學或臨床聲明，就必須確保一抗對其目標抗原的特異性。在操作中，研究人員不應*依賴商業(yè)供應商的說明。應根據(jù)之前的使用經驗以及文獻中確認有效的一抗來進行抗體選擇。查看制造商網(wǎng)站上的抗體數(shù)據(jù)表，查看IF染色的可用圖片并與自身期望相比較，或者與其他已發(fā)布的插圖進行比較。注意抗體的克隆號，因為單克隆抗體只與一個表位特異性結合，而多克隆抗體可識別多個表位，因此有可能存在非靶向結構的非特異性標記。所以，特異性較高且性能較優(yōu)的單克隆抗體通常更昂貴，但也能獲得更好的效果。
如希望開展多色間接IF實驗，則不同的一抗必須衍生自不同的物種，以便在之后通過熒光耦合二抗來區(qū)分免疫復合體（見表1）。比如，您希望使用小鼠衍生的抗體抗蛋白A、兔衍生的抗體抗蛋白B和大鼠衍生的抗體抗蛋白C來實施IF檢查。在選擇二抗時必須記住，每種抗體都只能特定識別一種一抗。此外，在這三種二抗的例子中，熒光色素的波長光譜必須不同，以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號。如今，可以買到與熒光色素相連的二抗，其波長范圍從紫外線到紅外線，幾乎可以針對任何物種的一抗。因此，研究人員目前僅受到現(xiàn)有顯微鏡（濾光片組、激發(fā)激光器）配置的限制。利用新型的激光器，可以擴展紅外一區(qū)的信號（圖一、二）。

表1：此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個細胞中同時標記三種不同的蛋白質。三種蛋白質的一抗必須來自不同的物種，以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來進行檢測。二抗的熒光色素必須在波長光譜上有所區(qū)分才能在顯微鏡下進行不同的分析。

圖一 常見熒光蛋白和熒光素的發(fā)射光譜

圖二 在近紅外一區(qū)，利用新型熒光標記可以獲得更多信號。Cos-7細胞圖像，使用SiR-Actin（657 – 740nm探測范圍）、AF750-Tom20（760 – 790nm）、AF790-Tubulin（810 – 850nm）標記。樣本由蘇黎世大學的Jana D?hner和Urs Ziegler提供。左：使用傳統(tǒng)的GaAsP探測器。右：使用STELLARIS 8。

了解了借助免疫熒光方法觀察細胞的原理，接下來獲得目標樣本并根據(jù)實驗設計合理制備用于熒光觀察的樣片。下一期將為您介紹如何為免疫熒光顯微鏡制備樣本。

今年，徠卡突破傳統(tǒng)免疫熒光多標數(shù)量的限制，開發(fā)了Cell DIVE超多標組織成像分析技術。通過循環(huán)染色的方法，可以實現(xiàn)一張組織切片，超過60個靶向蛋白的標記。從單張切片中，獲得更多的信息。