徠卡共聚焦課堂第二講：激發篇

 
從濾光片轉輪到聲光可調濾光器（AOTF）
熒光的激發需要特定顏色的光：既要有效地激發探針（波長接近探針激發光譜的最大值），又要留下足夠的空間收集發射光而不會進入檢測器的光路中。在共聚焦顯微鏡中，通常使用多譜線激光器或激光電池作為激發光源，這需要設備既能夠自由選擇適合當前實驗所用熒光團的激發譜線又能夠控制該激發譜線的強度因為直接在光源處控制強度時，大多數激光器會出現噪音增強的現象。AOTF（聲光可調濾光器）的引入簡化了濾光過程，同時顯著提高了實驗的靈活性。AOTF對于耦合白激光源是明智選擇。
濾光片轉輪-早期的濾光工具
共聚焦顯微鏡中熒光的激發光源是激光或不同顏色的激光組合。出于技術原因共聚焦選擇激光作為光源[2]。但是傳統激光器通常只發射一條或幾條單一波長的激光譜線（現代化解決方案是白光激光器[3]）。然而，生物醫學成像所使用的熒光染料的激發光譜從近紫外到近紅外的都有。大多數情況下，為了同時檢測幾種不同熒光染料的發射情況，需要通過二向色鏡結合一系列激光譜線來實現。在這種情況下，與在熒光照明中分離激發和發射光的“分光鏡"相比，反射鏡以反向模式使用。
由于通常激光器的低頻噪聲頻帶相對較窄，因此不建議直接通過激光功率控制強度。因此，需要一種設備來單獨減弱激光強度。同樣，如果關閉和打開光源次數過多，激光器壽命也會縮短。特別是氣體激光器，在關閉后仍處于高溫狀態而未冷卻時，不適合馬上再次開啟。
“激光電池"滿足以上所有要求，它由一系列激光器（通常為3-5個）組成。所有激光器均配有光閘，光閘由機電驅動并由軟件控制。所有激光器都需要一個用于減弱強度的伺服控制設備（一個帶有一系列灰度濾片濾光片轉輪或滑塊）多譜線激光器還需要另一個濾光片轉輪或滑塊，它包含一系列邊緣濾片和帶通濾片，以便選擇單譜線或組合譜線。
顯然，整個設置可能會變得略微復雜低效，容易出現錯位和漂移問題，可能在濾片選擇切換過程中引發機械振動。若改變激發方案，成像的效率將非常低下，由于安裝在濾光輪或滑塊上的濾光片數量有限，該設備靈活度不高。

 
圖1：傳統的“激光電池"帶有5個激光管、5個機械光閘、8個光束組合鏡、5個衰減濾光片轉輪和1個用于多參數共聚焦顯微鏡的選擇激發譜線濾光片轉輪。
聲光可調濾光器-運行方式
簡化機械設置并將靈活性提高幾個數量級的一個重要步驟是采用聲光可調濾光器（AOTF）。AOTF是一種可以控制所需顏色的光指向一個不同的方向的設備，而其余顏色的光直接通過 AOTF [1]。AOTF由晶體制成，通常是TeO₂或SiO₂或其他具有類似特性的化合物。晶體由機械轉換器在幾百兆赫范圍內的機械波激發（聲光可調濾光器的“聲"是指機械波，盡管頻率不符合人耳可聽見聲音的頻率）。最重要的是所需光束偏轉的方向是固定的，不會隨光的顏色而改變。此外，方向的進光量也可以通過機械波的振幅進行控制。
激光電池發射出不同波長的激光譜線（準直）后，AOTF可以選擇任意波長的譜線使之偏轉至所需方向，并可控制該譜線的能量。AOTF可以真正同時選擇多條譜線，譜線數量主要取決于采購設備具體情況。一個好的系統可同時提供8條譜線。
總而言之，AOTF用機械固定的單晶*取代了上述所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片，可以輕松實現任意譜線的組合；當激光電池同時提供8條譜線時，組合方式達到256種——這對于AOTF來說不是問題。另外：每條選定的譜線在強度上都是無級可控的。本質上，AOTF是一個“8-通道激光調光器"。
工程師可能會認為，AOTF將兩種偏振模式導向不同的方向。這是*正確的，并不損害概念。無論如何，激光都是偏振光，因此光將始終指向既定方向。垂直方向無激光，沒有任何指向。

 
圖2：在以傳統激光電池為光源的共聚焦照明中，AOTF（右邊的方框）替換了所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片，任何進入AOTF的譜線都可以得到抑制、衰減或*用于共聚焦顯微鏡。由激光器發射的任意譜線都可進行組合（組合數量大但有限）。
 
AOTF-額外的好處

 
圖3：用不同激光譜線或不同強度的同一條激光譜線掃描感興趣的區域。在激光譜線掃描期間，照明方式會根據預定義的模式在預設點發生變化。任何組合都是可能的，幾乎所有圖形都可以使用鼠標在預掃描的圖像上繪制。當然，也可應用幾何圖案（矩形、圓形、橢圓形……）。“零線"也是一種模式，常用于保護細胞培養物中的背景細胞。
 
聲光分束器可在特定樣本中進行任一符合熒光染料組成的激光組合。除此以外，假設用兩種不同的熒光染料對標本進行染色，一種非常強，另一種非常弱，而無級調諧通過調暗明亮染料的激發來檢測強度相似的兩種熒光，可以平衡熒光發射強度。因為AOTF的控制速度很快，不需要停止掃描過程，所以很容易在成像過程中即時實現， 
通過無級控制來平衡激發光強度，不僅有利于對比熒光通道，而且還是改善熒光染料光譜拆分的利器。許多染料的發射光譜出現“拖尾"現象，導致在成像的通道收集了錯誤的信號。通過將激發降低，可以改善發射光譜的拆分（抑制串色）。
 
最后，選定譜線的波長（和強度）之間的切換在幾微秒內完成，速度非常快；相比之下，機械標準濾光片轉輪大約需要一秒鐘。這種快速切換使得在單條譜線的掃描期間可以改變激發方式（采用何種波長的譜線，這些譜線分別對應多大強度）。此功能可在樣本上繪制用不同激發光激發的區域，即所謂的“感興趣區域"，在這些區域中，不同的激光被激活用于成像。此外，無需采集信號的區域不會被照射，非常好地保護了樣本以供日后研究。本文開頭的圖片展示了這類感興趣區域，在單次掃描中應用了5種不同的參數設置。
最后，如果選擇白光激光器作為光源，AOTF可以選擇白激光中任何可用的顏色。在此情況下，聲光可調濾光器將白激光光源變成可調光源。

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