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概述
熒光顯微鏡的基本原理是借助熒光染料對細胞成分進行高度特異性的可視化觀察。這可能是一種與興趣蛋白質(zhì)遺傳相關(guān)的熒光蛋白，如綠色熒光蛋白（GFP）等。如果克隆無法實現(xiàn)，例如在組織學(xué)樣本上無法實現(xiàn)，則需要使用另一種技術(shù)如免疫熒光染色來對興趣蛋白質(zhì)進行可視化觀察。為此，人們使用抗體來連接不同的熒光染料并將其直接或間接地結(jié)合到適當(dāng)?shù)陌悬c上。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡的應(yīng)用就不再僅局限于蛋白質(zhì)觀察，還能對核酸、多糖和其他結(jié)構(gòu)進行染色，甚至像鈣離子這樣的非生物物質(zhì)也能被檢出。本文就為大家介紹了幾種常用的熒光染料。
免疫熒光
在熒光顯微鏡下，有兩種方法可以顯示興趣蛋白質(zhì)。可以借助內(nèi)在的熒光信號，也就是通過克隆從而在基因?qū)用姘岩粋€熒光蛋白和一個靶蛋白聯(lián)系起來；又或者借助熒光標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合到興趣蛋白質(zhì)上。對于某些生物學(xué)問題來說，后者更為實用甚至更為必要。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，通常樣本來自不含任何熒光蛋白的生物體，所以不可能使用熒光蛋白。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)要快得多，因為熒光蛋白方法必須克隆興趣基因并將DNA轉(zhuǎn)染到相應(yīng)細胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于其本身就是一種蛋白質(zhì)。因此細胞內(nèi)就具備了特定的蛋白質(zhì)特性，因而可能導(dǎo)致功能紊亂或?qū)λY(jié)合的興趣蛋白產(chǎn)生干擾。當(dāng)然，值得注意的是，熒光蛋白通常是觀察活細胞的方法。
免疫熒光利用抗體對抗原的特異性結(jié)合親和力。此處可存在兩種不同的結(jié)構(gòu)。簡單的方法是使用一種熒光標(biāo)記的抗體，該抗體與興趣蛋白結(jié)合，稱為直接免疫熒光。
大多數(shù)情況下會使用兩種形式的抗體。第1抗體與靶蛋白結(jié)合，自身（1st抗體）沒有熒光標(biāo)記。但與第1抗體結(jié)合的第2抗體（2nd抗體）特異性攜帶熒光染料，這種方法被稱為間接免疫熒光。間接免疫熒光有幾個優(yōu)點，一方面會存在放大效應(yīng)，因為不止有一種第2抗體與一種第1抗體結(jié)合。另一方面，針對您興趣蛋白，不需要一直用熒光染料標(biāo)記每種抗體，可以使用市售熒光標(biāo)記的第2抗體。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料是FITC、TRITC或以下提到的幾種Alexa Fluor®染料。
FITC和TRITC
異硫氰酸熒光素（FITC）是一種有機熒光染料，目前仍用于免疫熒光和流式細胞術(shù)當(dāng)中。該染料在495/517nm處存在激發(fā)/發(fā)射峰，而且可借助其反應(yīng)性異硫氰酸酯基團與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨酰或羰基結(jié)合而與不同的抗體偶聯(lián)。它的基本結(jié)構(gòu)，即熒光黃的分子量為332g/mol，常用作熒光示蹤劑。FITC（389g/mol）是最早用于熒光顯微術(shù)的染料之一，也是Alexa-fluor488等熒光染料的來源。它的熒光活性源于其自身的大共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，在藍色光譜中會被光所激發(fā)。
圖 1： 果蠅胚胎發(fā)育，綠色： FITC，紅色： TRITC。
經(jīng)常與FITC配合使用的一種染料是同出一門的TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6）-異硫氰酸酯）。與FITC不同，TRITC不是熒光素，而是羅丹明系列衍生物。羅丹明也存在一個大的共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，因此可以發(fā)出熒光。與FITC不一樣，TRITC（479g/mol）在綠色光譜中被激發(fā)，最大值出現(xiàn)在550nm處，最大發(fā)射波長為573nm。與蛋白質(zhì)（如抗體）的結(jié)合也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團。
即使FITC和TRITC仍在使用，但考慮到兩者屬于相當(dāng)弱的熒光染料，不建議用于先進的顯微術(shù)。兩者的優(yōu)勢主要還是在于成本低。
花青素
這種相對較小的熒光染料集合源于花青素并因此而得名：Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。這些染料都可以通過反應(yīng)基團與核酸或蛋白質(zhì)相連。例如，蛋白質(zhì)標(biāo)記使用馬來酰胺基團。有趣的是，熒光方面Cy5對周圍的電子環(huán)境很敏感，這可用于酶的測定。黏附蛋白的構(gòu)象變化導(dǎo)致熒光發(fā)射的正負(fù)變化。此外，Cy3和Cy5可用于FRET實驗。花青素染料是比較古老的熒光染料，也是其它熒光染料的基礎(chǔ)，具有亮度高、光穩(wěn)定性好、量子效率高等優(yōu)點。
圖 2： 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎、肢間體節(jié)、E10.5小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的5個肢間體節(jié)： EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488免疫組化染色；用Desmin-Cy3對胚胎肌肉纖維進行染色，用Hoechst揭示細胞核，自上而下尺寸： 3.5毫米 (a)、800微米 (b)。 樣本提供： Aurélie Jory，法國巴黎巴斯德研究院干細胞與發(fā)育以及遺傳與分子細胞生物學(xué)研究所 (IGBMC) 成像中心
圖 3： 小鼠成纖維細胞，綠色： F-Actin、FITC，紅色： Tubulin、Cy5，藍色： 細胞核，DAPI。 樣本提供： 德國海德堡馬克斯-普朗克醫(yī)學(xué)研究所 Günter Giese 博士
DNA染色處理
在熒光顯微術(shù)中，不僅蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)感興趣，而且對核酸也感興趣。有時有必要通過檢測細胞核來確定細胞的確切位置或數(shù)量。最常見的DNA染色劑之一是DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要與DNA雙螺旋富含A-T的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合態(tài)相比，DAPI在DNA上的熒光強度增加。染料被UV（紫外線）光激發(fā)，最大激發(fā)波長為358nm。發(fā)射光譜較寬，峰值在461nm。弱熒光也可以檢測到RNA結(jié)合。在這種情況下，發(fā)射轉(zhuǎn)移到500nm。有趣的是，DAPI能夠滲透完整的細胞膜。因此，該染料既可用于固定細胞也可用于活細胞。
第二種廣泛使用的DNA染色方法是Hoechst染料，最初由化學(xué)公司Hoechst AG生產(chǎn)。Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455 nm下發(fā)射最大值，在無結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540 nm。Hoechst染料還具有細胞滲透作用，因此可用于固定細胞和活細胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。
DNA染色劑碘化丙啶無法透過細胞膜。在細胞培養(yǎng)中，因為該染色劑無法進入完好的細胞內(nèi)，所以常常被用來區(qū)分活細胞和死細胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其最大激發(fā)波長為538nm，最高發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的最大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長和較弱的強度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。
吖啶橙是一種染料，可以在DNA和RNA之間形成差異區(qū)分而無需事先操作。其最大激發(fā)/發(fā)射對在DNA結(jié)合態(tài)為502nm/525nm，在RNA結(jié)合態(tài)為460nm/650nm。此外，該染料還可以進入酸性間室中，如溶酶體。陽離子染料在酸性間室中質(zhì)子化。在酸性環(huán)境中，吖啶橙受藍色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射*。因為凋亡細胞有很多被吞噬的酸性間室，因此也讓該染料成為了這類細胞常用的標(biāo)記物。
間室與細胞器特異性染料
在熒光顯微鏡下，對細胞間室如溶酶體或核內(nèi)體和細胞器如線粒體等進行染色通常較為合理。為此，本節(jié)將介紹一組特定染料組合。
觀察線粒體時一種*的方法是使用MitoTracker®。這是一種細胞滲透性染料，具有溫和的巰基活性氯甲基部分。該染料可以通過與半胱氨酸殘基的自由巰基反應(yīng)，與基質(zhì)蛋白共價結(jié)合。MitoTracker®有不同的顏色和改良成分（見表1），也是Molecular Probes的商標(biāo)。與傳統(tǒng)的線粒體特異性染色劑如羅丹明123或四甲基玫瑰胺不同的是，在用固定劑破壞膜電位后MitoTracker®不會被洗掉。
根據(jù)線粒體染色情況，還有染料標(biāo)記酸性間室如溶酶體等，稱為LysoTracker。這些是與熒光團相連的膜滲透性弱堿。由于質(zhì)子化作用，這些堿很有可能與酸性間室有親和力。LysoTracker也有不同的顏色（見表1）。
與溶酶體類似的間室為真菌液泡，如釀酒酵母。這種薄膜包圍的空間也具有酸性。在熒光顯微鏡下觀察它的方法之一是使用苯乙烯基染料，如FM 4-64®或FM 5-95®。
在蛋白質(zhì)分泌實驗方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）尤為值得注意。對這種間室進行染色的一種經(jīng)典染料是DiOC6(3)。這種染料雖然偏向與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，但也能與線粒體膜等其他膜結(jié)合。另一種特定染色ER的方法是使用ER-Tracker，如綠色和紅色ER-Tracker。這兩種染料都是以BODIPY為基礎(chǔ)的染料，與格列本脲（一種磺酰脲酶）有關(guān)，能與ER膜上*的ATP敏感鉀通道結(jié)合。BODIPY（硼二吡咯甲基）描述了一組相對pH不敏感的染料，這些染料幾乎都不溶于水。這類染料并不是很好的蛋白質(zhì)標(biāo)記工具，但用于脂質(zhì)和膜標(biāo)記時效果較佳。
ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經(jīng)酰胺類似物如 NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺進行標(biāo)示。神經(jīng)酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。
在進一步脂質(zhì)基染料的幫助下還有可能對特殊的膜區(qū)域，如脂質(zhì)筏等進行染色。這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6膽固醇或NBP-12膽固醇等（Avanti極性脂質(zhì)）來進行可視化觀察。
除了使用特殊的非蛋白熒光染料來標(biāo)記細胞間室外，還可以借助于對細胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色興趣區(qū)域。這些蛋白質(zhì)可以連接到熒光染料上，并在熒光顯微鏡下顯示出來。這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素（WGA）的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。WGA與熒光染料偶聯(lián)。用它可以觀察到質(zhì)膜。
圖 4： Pukinje細胞，三色標(biāo)記的小鼠小腦皮質(zhì)矢狀切片。 紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色：anti-GFAP/Cy5，藍色： Hoechst 33258
圖 5： 牛肺內(nèi)皮細胞。 紅色： MitoTracker® Red CMXRos 標(biāo)記的線粒體，綠色： 綠色熒光BODIPY® FL phallacidin標(biāo)記的纖維狀肌動蛋白，藍色： DAPI 標(biāo)記的細胞核。 此圖像采用3D盲反卷積方法提高了圖像質(zhì)量
ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經(jīng)酰胺類似物如NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺進行標(biāo)記。 神經(jīng)酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。
在其他脂質(zhì)基染料的幫助下還可以對特殊的膜區(qū)域如脂質(zhì)筏等進行染色。 這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6 膽固醇或NBP-12 膽固醇等（Avanti極性脂質(zhì)）來進行可視化觀察。
還可以借助于對細胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色感興趣區(qū)域。 這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素(WGA)的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。
功能實驗
“功能實驗"是一個統(tǒng)稱，指的是評估各種功能的標(biāo)準(zhǔn)化實驗，這些功能可以用熒光標(biāo)志物進行可視化觀察。 這些標(biāo)志物包括但不限于上述任何標(biāo)記技術(shù)和熒光團。 對于其中的許多功能實驗而言，染色試劑盒可在市場上買到，并且可以輕松用于各種樣本。 功能實驗的一個例子是大家都知道且廣泛使用的活細胞/死細胞實驗。 兩個熒光團分別用于標(biāo)記活細胞和死細胞。 在同時掌握這兩個值的情況下，就可以評估細胞的總體健康狀況。 將此信息與其他標(biāo)志物關(guān)聯(lián)起來還可以加深對底層過程的理解。
熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長峰值
以上提到的全部染料都在下表中列出。此外，表中還提到了其他熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射的波長峰值。
圖 6： Alexa 488（綠色曲線）和 Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個發(fā)射光譜的重疊顯而易見。 紅線表示 488 發(fā)射光濾光鏡的帶通。
表1
| 熒光染料樣本示例 | 激發(fā) | 發(fā)射 |
| Indo-1, Ca saturated | 331 nm | 404 nm |
| Indo-1 Ca2+ | 346 nm | 404 nm |
| Cascade Blue BSA pH 7.0 | 401 nm | 419 nm |
| Cascade Blue | 398 nm | 420 nm |
| LysoTracker Blue | 373 nm | 421 nm |
| Alexa 405 | 401 nm | 421 nm |
| LysoSensor Blue pH 5.0 | 374 nm | 424 nm |
| LysoSensor Blue | 374 nm | 424 nm |
| DyLight 405 | 399 nm | 434 nm |
| DyLight 350 | 332 nm | 435 nm |
| BFP（藍色熒光蛋白） | 380 nm | 439 nm |
| Alexa 350 | 343 nm | 441 nm |
| 7-氨基-4-甲基豆素pH 7.0 | 346 nm | 442 nm |
| 氨基豆素 | 345 nm | 442 nm |
| AMCA共軛物 | 347 nm | 444 nm |
| 豆素 | 360 nm | 447 nm |
| 7-羥基-4-甲基豆素 | 360 nm | 447 nm |
| 7-羥基-4-甲基豆素pH 9.0 | 361 nm | 448 nm |
| 6.8-二氟-7-羥基-4-甲基豆素pH 9.0 | 358 nm | 450 nm |
| Hoechst 33342 | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue | 404 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258 | 352 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258-DNA | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue抗體共軛物pH 8.0 | 404 nm | 455 nm |
| PO-PRO-1 | 434 nm | 457 nm |
| PO-PRO-1-DNA | 435 nm | 457 nm |
| POPO-1 | 433 nm | 457 nm |
| POPO-1-DNA | 433 nm | 458 nm |
| DAPI-DNA | 359 nm | 461 nm |
| DAPI | 358 nm | 463 nm |
| Marina Blue | 362 nm | 464 nm |
| SYTOX Blue-DNA | 445 nm | 470 nm |
| CFP（青色熒光蛋白） | 434 nm | 474 nm |
| eCFP（增強型青色熒光蛋白） | 437 nm | 476 nm |
| 1-苯胺鄰苯二甲酸-8-磺酸（1,8-ANS） | 375 nm | 479 nm |
| Indo-1, Ca free | 346 nm | 479 nm |
| 1,8-ANS（1-苯胺鄰苯二甲酸-8-磺酸） | 375 nm | 480 nm |
| BO-PRO-1-DNA | 462 nm | 482 nm |
| BOPRO-1 | 462 nm | 482 nm |
| BOBO-1-DNA | 461 nm | 484 nm |
| SYTO 45-DNA | 451 nm | 486 nm |
| evoglow-Pp1 | 448 nm | 495 nm |
| evoglow-Bs1 | 448 nm | 496 nm |
| evoglow-Bs2 | 448 nm | 496 nm |
| Auramine O | 431 nm | 501 nm |
| DiO | 487 nm | 501 nm |
| LysoSensor Green pH 5.0 | 447 nm | 502 nm |
| Cy 2 | 489 nm | 503 nm |
| LysoSensor Green | 447 nm | 504 nm |
| Fura-2, high Ca | 336 nm | 504 nm |
| Fura-2 Ca2+sup> | 336 nm | 505 nm |
| SYTO 13-DNA | 488 nm | 506 nm |
| YO-PRO-1-DNA | 491 nm | 507 nm |
| YOYO-1-DNA | 491 nm | 509 nm |
| eGFP（增強型青色熒光蛋白） | 488 nm | 509 nm |
| LysoTracker Green | 503 nm | 509 nm |
| GFP (S65T) | 489 nm | 509 nm |
| BODIPY FL, MeOH | 502 nm | 511 nm |
| Sapphire | 396 nm | 511 nm |
| BODIPY FL共軛物 | 503 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green | 490 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green FM, MeOH | 490 nm | 512 nm |
| 熒光素0.1 M NaOH | 493 nm | 513 nm |
| 鈣黃綠素pH 9.0 | 494 nm | 514 nm |
| 熒光素pH 9.0 | 490 nm | 514 nm |
| 鈣黃綠素 | 493 nm | 514 nm |
| Fura-2, no Ca | 367 nm | 515 nm |
| Fluo-4 | 494 nm | 516 nm |
| FDA | 495 nm | 517 nm |
| DTAF | 495 nm | 517 nm |
| 熒光素 | 495 nm | 517 nm |
| 熒光素抗體共軛物 pH 8.0 | 493 nm | 517 nm |
| CFDA | 495 nm | 517 nm |
| FITC | 495 nm | 517 nm |
| Alexa Fluor 488肼類-水 | 493 nm | 518 nm |
| DyLight 488 | 493 nm | 518 nm |
| 5-FAM pH 9.0 | 492 nm | 518 nm |
| FITC抗體共軛物pH 8.0 | 495 nm | 519 nm |
| Alexa 488 | 493 nm | 520 nm |
| 羅丹明110 | 497 nm | 520 nm |
| 羅丹明110 pH 7.0 | 497 nm | 520 nm |
| 吖啶橙 | 431 nm | 520 nm |
| Alexa Fluor 488抗體共軛物 pH 8.0 | 499 nm | 520 nm |
| BCECF pH 5.5 | 485 nm | 521 nm |
| PicoGreendsDNA量化試劑 | 502 nm | 522 nm |
| SYBR Green I | 498 nm | 522 nm |
| 羅丹明Green pH 7.0 | 497 nm | 523 nm |
| CyQUANT GR-DNA | 502 nm | 523 nm |
| NeuroTrace 500/525，綠色熒光 Nissl染色-RNA | 497 nm | 524 nm |
| DansylCadaverine | 335 nm | 524 nm |
| Rhodol Green抗體共軛物 pH 8.0 | 499 nm | 524 nm |
| Fluoro-Emerald | 495 nm | 524 nm |
| Nissl | 497 nm | 524 nm |
| 熒光素葡聚糖pH 8.0 | 501 nm | 524 nm |
| 羅丹明綠色 | 497 nm | 524 nm |
| 5-（和-6）-羧基-2'，7'-二氯熒光素pH 9.0 | 504 nm | 525 nm |
| DansylCadaverine, MeOH | 335 nm | 526 nm |
| eYFP （增強型黃色熒光蛋白） | 514 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 | 498 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488抗體共軛物 pH 8.0 | 498 nm | 526 nm |
| Fluo-3 | 506 nm | 527 nm |
| BCECF pH 9.0 | 501 nm | 527 nm |
| SBFI-Na+ | 336 nm | 527 nm |
| Fluo-3 Ca2+ | 506 nm | 527 nm |
| 羅丹明123, MeOH | 507 nm | 529 nm |
| FlAsH | 509 nm | 529 nm |
| 鈣綠-1 Ca2+ | 506 nm | 529 nm |
| 鎂綠 | 507 nm | 530 nm |
| DM-NERF pH 4.0 | 493 nm | 530 nm |
| 鈣綠 | 506 nm | 530 nm |
| 檸檬黃 | 515 nm | 530 nm |
| LysoSensor Yellow pH 9.0 | 335 nm | 530 nm |
| TO-PRO-1-DNA | 515 nm | 531 nm |
| 鎂綠Mg2+ | 507 nm | 531 nm |
| 鈉綠Na+ | 507 nm | 531 nm |
| TOTO-1-DNA | 514 nm | 531 nm |
| Oregon Green 514 | 512 nm | 532 nm |
| Oregon Green 514抗體共軛物 pH 8.0 | 513 nm | 533 nm |
| NBD-X | 466 nm | 534 nm |
| DM-NERF pH 7.0 | 509 nm | 537 nm |
| NBD-X, MeOH | 467 nm | 538 nm |
| CI-NERF pH 6.0 | 513 nm | 538 nm |
| Alexa 430 | 431 nm | 540 nm |
| Alexa Fluor 430抗體共軛物 pH 7.2 | 431 nm | 540 nm |
| CI-NERF pH 2.5 | 504 nm | 541 nm |
| Lucifer Yellow, CH | 428 nm | 542 nm |
| LysoSensor Yellow pH 3.0 | 389 nm | 542 nm |
| 6-TET, SE pH 9.0 | 521 nm | 542 nm |
| Eosin抗體共軛物 pH 8.0 | 525 nm | 546 nm |
| Eosin | 524 nm | 546 nm |
| 6-Carboxy羅丹明6G pH 7.0 | 526 nm | 547 nm |
| 6-Carboxy羅丹明6G, hydrochloride | 525 nm | 547 nm |
| Bodipy R6G SE | 528 nm | 547 nm |
| BODIPY R6G, MeOH | 528 nm | 547 nm |
| 6 JOE | 520 nm | 548 nm |
| Cascade Yellow抗體共軛物 pH 8.0 | 399 nm | 549 nm |
| Cascade Yellow | 399 nm | 549 nm |
| mBanana | 540 nm | 553 nm |
| Alexa Fluor 532抗體共軛物 pH 7.2 | 528 nm | 553 nm |
| Alexa 532 | 528 nm | 553 nm |
| Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0 | 533 nm | 554 nm |
| 6-HEX, SE pH 9.0 | 534 nm | 559 nm |
| mOrange | 548 nm | 562 nm |
| mHoneydew | 478 nm | 562 nm |
| Cy 3 | 549 nm | 562 nm |
| 羅丹明B | 543 nm | 565 nm |
| DiI | 551 nm | 565 nm |
| 5-TAMRA-MeOH | 543 nm | 567 nm |
| Alexa 555 | 553 nm | 568 nm |
| Alexa Fluor 555抗體共軛物 pH 7.2 | 553 nm | 568 nm |
| DyLight 549 | 555 nm | 569 nm |
| BODIPY TMR-X, SE | 544 nm | 570 nm |
| BODIPY TMR-X, MeOH | 544 nm | 570 nm |
| PO-PRO-3-DNA | 539 nm | 571 nm |
| PO-PRO-3 | 539 nm | 571 nm |
| 羅丹明 | 551 nm | 573 nm |
| Bodipy TMR-X conjugate | 544 nm | 573 nm |
| POPO-3 | 533 nm | 573 nm |
| Alexa 546 | 562 nm | 573 nm |
| BODIPY TMR-X抗體共軛物 pH 7.2 | 544 nm | 573 nm |
| Calcium Orange Ca2+ | 549 nm | 573 nm |
| TRITC | 550 nm | 573 nm |
| Calcium Orange | 549 nm | 574 nm |
| 羅丹明鬼筆環(huán)肽 pH 7.0 | 558 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange | 551 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange, MeOH | 551 nm | 575 nm |
| 藻紅蛋白 | 565 nm | 575 nm |
| 鎂橙 | 550 nm | 575 nm |
| R-藻紅蛋白pH 7.5 | 565 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA pH 7.0 | 553 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA | 549 nm | 577 nm |
| Rhod-2 | 552 nm | 577 nm |
| FM 1-43 | 472 nm | 578 nm |
| Rhod-2 Ca2+ | 553 nm | 578 nm |
| 四甲羅丹明抗體共軛物 pH 8.0 | 552 nm | 578 nm |
| FM 1-43 lipid | 473 nm | 579 nm |
| LOLO-1-DNA | 568 nm | 580 nm |
| dTomato | 554 nm | 581 nm |
| DsRed | 563 nm | 581 nm |
| Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide | 372 nm | 582 nm |
| 四甲羅丹明dextran pH 7.0 | 555 nm | 582 nm |
| Fluor-Ruby | 554 nm | 582 nm |
| Resorufin | 571 nm | 584 nm |
| Resorufin pH 9.0 | 571 nm | 584 nm |
| mTangerine | 568 nm | 585 nm |
| LysoTracker Red | 578 nm | 589 nm |
| Lissamine羅丹明 | 572 nm | 590 nm |
| Cy 3.5 | 578 nm | 591 nm |
| 羅丹明Red-X抗體共軛物 pH 8.0 | 573 nm | 591 nm |
| Sulfo羅丹明101, EtOH | 578 nm | 593 nm |
| JC-1 pH 8.2 | 593 nm | 595 nm |
| JC-1 | 592 nm | 595 nm |
| mStrawberry | 575 nm | 596 nm |
| MitoTracker Red | 578 nm | 599 nm |
| MitoTracker Red, MeOH | 578 nm | 599 nm |
| X-Rhod-1 Ca2+ | 580 nm | 602 nm |
| Alexa Fluor 568抗體共軛物 pH 7.2 | 579 nm | 603 nm |
| Alexa 568 | 576 nm | 603 nm |
| 5-ROX pH 7.0 | 578 nm | 604 nm |
| 5-ROX（5-羥基-X-羅丹明，三乙基銨鹽） | 578 nm | 604 nm |
| BO-PRO-3-DNA | 574 nm | 604 nm |
| BOPRO-3 | 574 nm | 604 nm |
| BOBO-3-DNA | 570 nm | 605 nm |
| 溴化乙錠 | 524 nm | 605 nm |
| ReAsH | 597 nm | 608 nm |
| 鈣深紅 | 589 nm | 608 nm |
| 鈣深紅Ca2+ | 590 nm | 608 nm |
| mRFP | 585 nm | 608 nm |
| mCherry | 587 nm | 610 nm |
| Texas Red-X抗體共軛物 pH 7.2 | 596 nm | 613 nm |
| HcRed | 590 nm | 614 nm |
| DyLight 594 | 592 nm | 616 nm |
| 乙二胺同二聚體-1-DNA | 528 nm | 617 nm |
| 乙二胺同二聚體 | 528 nm | 617 nm |
| 碘化丙啶 | 538 nm | 617 nm |
| SYPRO Ruby | 467 nm | 618 nm |
| 碘化丙啶-DNA | 538 nm | 619 nm |
| Alexa 594 | 590 nm | 619 nm |
| BODIPY TR-X, SE | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X, MeOH | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X 鬼筆環(huán)肽pH 7.0 | 590 nm | 621 nm |
| YO-PRO-3-DNA | 613 nm | 629 nm |
| Di-8 ANEPPS | 469 nm | 630 nm |
| Di-8-ANEPPS-lipid | 469 nm | 631 nm |
| YOYO-3-DNA | 612 nm | 631 nm |
| Nile Red-lipid | 553 nm | 636 nm |
| Nile Red | 559 nm | 637 nm |
| DyLight 633 | 624 nm | 646 nm |
| mPlum | 587 nm | 649 nm |
| TO-PRO-3-DNA | 642 nm | 657 nm |
| DDAO pH 9.0 | 648 nm | 657 nm |
| Fura Red, high Ca | 434 nm | 659 nm |
| 別藻藍蛋白pH 7.5 | 651 nm | 660 nm |
| APC (allophycocyanin) | 650 nm | 660 nm |
| Nile Blue, EtOH | 631 nm | 660 nm |
| TOTO-3-DNA | 642 nm | 661 nm |
| Cy 5 | 646 nm | 664 nm |
| BODIPY 650/665-X, MeOH | 646 nm | 664 nm |
| Alexa Fluor 647 R-藻菊酯鏈霉親和素pH 7.2 | 569 nm | 666 nm |
| DyLight 649 | 652 nm | 668 nm |
| Alexa Fluor 647抗體共軛物 pH 7.2 | 653 nm | 668 nm |
| Alexa 647 | 653 nm | 669 nm |
| Fura Red Ca2+ | 435 nm | 670 nm |
| Atto 647 | 644 nm | 670 nm |
| Fura Red, low Ca | 472 nm | 673 nm |
| 羧萘熒光素pH 10.0 | 600 nm | 674 nm |
| Alexa 660 | 664 nm | 691 nm |
| Alexa Fluor 660抗體共軛物 pH 7.2 | 663 nm | 691 nm |
| Cy 5.5 | 673 nm | 692 nm |
| Alexa Fluor 680抗體共軛物 pH 7.2 | 679 nm | 702 nm |
| Alexa 680 | 679 nm | 703 nm |
| DyLight 680 | 678 nm | 706 nm |
| Alexa Fluor 700抗體共軛物 pH 7.2 | 696 nm | 719 nm |
| Alexa 700 | 696 nm | 720 nm |
| FM 4-64, 2% CHAPS | 506 nm | 751 nm |
| FM 4-64 | 508 nm | 751 nm |
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