用SRS顯微鏡對(duì)配方產(chǎn)品進(jìn)行表征分析

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）可提供具有高空間和時(shí)間分辨率的無(wú)標(biāo)記化學(xué)信息，因此非常適合用于可視化配方產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)，包括監(jiān)測(cè)單一成分在使用期間的所帶來(lái)的結(jié)果（包括在使用期間監(jiān)測(cè)單一組分的命運(yùn)）。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)睦灰?，可以從預(yù)先存在的單個(gè)成分的拉曼光譜（圖1左），或從獲取λ掃描生成的SRS光譜（見下文，以及圖3中的示例）進(jìn)行SRS對(duì)比，從而對(duì)單一成分進(jìn)行成像。

除了這些對(duì)比波數(shù)外，還應(yīng)在附近預(yù)期無(wú)拉曼強(qiáng)度的波數(shù)處獲取“非共振"控制圖像（見圖2中的示例），從而確保檢測(cè)到的信號(hào)基于拉曼光譜，并能識(shí)別任何雜散信號(hào)，如激光吸收產(chǎn)生的偽影。在各成分/相的所需波數(shù)下獲得圖像后，可將圖像合并成一個(gè)復(fù)合圖像，從而了解材料中不同成分之間的關(guān)聯(lián)性。除了SRS對(duì)比，還可通過(guò)使用二次諧波生成或熒光等方法來(lái)同時(shí)成像，獲得其他結(jié)構(gòu)信息。圖2中的圖像顯示了用SRS顯微鏡成像的防曬霜樣品中油vs水的相位分布，以及用SHG可視化的氧化鋅顆粒。

SRS光譜可通過(guò)執(zhí)行λ掃描來(lái)生成，在此期間，SRS圖像在泵浦光束的波長(zhǎng)上以非常小的增量被捕獲，以生成跨越感興趣波數(shù)范圍的圖像棧。圖3顯示了在含有多種活性成分的皮膚用藥物配方上獲得的這種λ掃描圖像棧。當(dāng)泵浦光束掃過(guò)與拉曼光譜的指紋區(qū)相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)時(shí)，不同的成分依次受到激發(fā)，因?yàn)槠洳〝?shù)受到刺激。獲得這些圖像棧后，可立即選擇相關(guān)特征來(lái)生成感興趣區(qū)域（ROI）。從這些ROI中，通過(guò)繪制ROI SRS信號(hào)強(qiáng)度和泵浦光束波長(zhǎng)（可轉(zhuǎn)換為波數(shù)）的關(guān)系，生成SRS光譜。有時(shí)，為波長(zhǎng)堆棧中所有圖像生成最大投影有助于在一張圖像中實(shí)現(xiàn)所有特征的可視化，確保不會(huì)遺漏任何重要特征。

從λ掃描中生成SRS光譜后，可立即將這些光譜與單一成分的自發(fā)拉曼光譜進(jìn)行比較。將光譜信息與圖像中的形態(tài)信息相結(jié)合，對(duì)配方的問(wèn)題分析具有重大價(jià)值，如識(shí)別是否存在多晶、共晶或氧化產(chǎn)物。

除了分析配方本身的特性外，SRS顯微鏡也可用于對(duì)單一成分使用后帶來(lái)的最終結(jié)果進(jìn)行可視化。例如，監(jiān)測(cè)化學(xué)品在皮膚中的滲透，這在藥物輸送和化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。圖4顯示了4-氰基苯酚給藥后皮膚的圖像。將組織冷凍切片，用SRS成像，以在2235 cm^-1（品紅色）處通過(guò)腈基官能團(tuán)的對(duì)比來(lái)顯示這種化合物的分布。在2850 cm^-1處使用CH2鍵振動(dòng)模式（紅色）、在1666 cm^-1處采用酰胺I（藍(lán)色）以及使用SHG通道的膠原蛋白分布（綠色），對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

由于SRS信號(hào)與濃度呈線性關(guān)系，因此有可能通過(guò)圖像分析提取某些定量信息，例如，化學(xué)物質(zhì)的相對(duì)濃度和皮膚深度。對(duì)于在同一共焦平面上成像的物理截面，該操作合理且簡(jiǎn)單。然而，當(dāng)對(duì)三維標(biāo)本進(jìn)行成像時(shí)，必須對(duì)激光散射和隨著深度增加產(chǎn)生的吸收所致的信號(hào)損失進(jìn)行校正。

試圖對(duì)不含dute化學(xué)官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行成像時(shí)，有時(shí)很難獲得特定的對(duì)比度。在這種情況下，對(duì)感興趣的分子進(jìn)行氘化，可幫助將峰值轉(zhuǎn)移到拉曼光譜的生物“沉默"區(qū)域，該區(qū)域的組織中幾乎無(wú)自然存在的信號(hào)。這種方法可便于對(duì)敏感和化學(xué)特異性成分進(jìn)行可視化，而無(wú)需引入會(huì)擾亂物理化學(xué)特性，從而擾亂藥代動(dòng)力學(xué)特征的熒光基團(tuán)。另外，還可采用多變量數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)不同成分進(jìn)行光譜拆分。